DIGESTIBILIDADE E FERMENTAÇÃO IN VITRO EM CÃES E GATOS: UM CAMINHO PARA REDUZIR O USO DE ANIMAIS
Introdução
A nutrição de cães e gatos têm buscado compreender como a microbiota intestinal impacta na saúde dos animais, bem como de que forma novas fontes alimentares podem ser aproveitadas pelo organismo. Pesquisas envolvendo novos ingredientes e aditivos têm avaliado sua digestibilidade e capacidade de modular o ambiente intestinal, relatando alterações nas comunidades bacterianas e nos produtos de fermentação. Macroingredientes como fontes de fibra e proteína e aditivos como óleos essenciais, prebióticos, probióticos e posbióticos tem sido extensivamente estudados (Bastos et al., 2020; de Oliveira Matheus et al., 2021; Souza et al., 2023; Soares et al., 2023; Bastos et al., 2023; Souza et al., 2023; Souza et al., 2025; Mioto et al., 2025).
Contudo, as metodologias atuais para avaliação da microbiota fecal in vivo, requerem um período de adaptação do trato gastrointestinal à dieta, semelhante aos protocolos de análises de digestibilidade, que estabelecem um período mínimo de 5 dias de adaptação (Brito et al., 2020). Apesar disto, a microbiota se modifica além deste período, durante a ingestão de alimentos, conforme observado por Santos et al. (2025), que observaram alterações na população microbiana fecal ao longo dos dias 30 dias de avaliação, demonstrando que as comunidades bacterianas podem se modificar progressivamente durante o período de ingestão à dieta.
Em filhotes, a avaliação dos efeitos da dieta sobre a digestibilidade e microbiota fecal pode ser ainda mais desafiadora, pela dificuldade de estrutura com animais nesta faixa etária, e interferentes fisiológicos (Fernandes et al., 2026), os quais são muito dinâmicos nesta fase, além dos ambientais (Sacoor et al., 2024; Melotto et al., 2025; Banik et al., 2026).
Além dos desafios citados acima, estudos em gatos apresentam limitações adicionais às observadas em cães, relacionadas principalmente ao comportamento noturno da espécie da espécie, e maior sensibilidade dos animais a alterações ambientais e de manejo, que podem desencadear estresse, afetando os resultados experimentais. Outro ponto importante nestes estudos in vivo sobre a interrelação entre dieta e microbiota fecal é a necessidade de manter os animais em ambiente individual durante a coleta de fezes, frequentemente em gaiolas metabólicas, os quais podem comprometer as condições de bem-estar (Sato et al., 2020; Bastos et al., 2023).
Dessa forma, a aplicação de metodologias in vitro para avaliar alimentos para animais representam uma alternativa dentro da pesquisa, possibilitando avaliações mais rápidas, com menor utilização de animais e controle de fatores ambientais e individuais. No entanto, as limitações atuais são a falta de validação destas metodologias e a ausência de dados científicos que demonstrem boa associação entre resultados obtidos em animais e in vitro. Neste sentido, neste artigo, serão abordados alguns resultados de pesquisa sobre a associação destas metodologias.
Métodos in vitro de simulação gástrica, fermentação intestinal e microbiota fecal
Avaliação da digestibilidade:
Recentemente, o número de pesquisas aplicando métodos in vitro para avaliar dietas para cães e gatos têm demonstrado resultados interessantes. Hervera et al. (2007) encontraram uma correlação linear entre a digestibilidade da matéria orgânica avaliada in vivo com a in vitro (r2=0,92) avaliada em alimentos para cães. O método in vitro proposto por esse estudo foi divido em duas etapas: 1) incubação do alimento (1g de ração) com a adição de pepsina durante 2 horas em pH ácido, 2) posteriormente, esse alimento foi incubado por mais 4 horas juntamente com a inclusão da pancreatina, simulando a digestão intestinal. A digestibilidade do alimento consistiu na avaliação do desaparecimento da matéria orgânica do resíduo não digerido após a filtragem e a queima.
Apesar desse estudo citado apresentar resultados de digestibilidade da matéria seca in vitro e in vivo com excelente correlação, a análise dos macronutrientes, ainda carecem de mais pesquisas. Biagi et al. (2016), observaram uma digestibilidade da proteína bruta acima de 84%, entretanto, a acurácia da digestibilidade do método in vitro foi de apenas r2=0,51. Baixas correlações também foram observadas ao avaliar a digestibilidade do extrato etéreo (r2=0,38) e do amido (r2=0,16). Ainda, o impacto da avaliação in vitro de micronutrientes, também carecem de mais padronizações, principalmente que levem em consideração apresentações diferentes de dietas (úmidas e seca) e concentração de cálcio e fósforo (Soutar et al., 2021).
Em humanos, a aplicação de métodos in vitro está mais avançada, com trabalhos avaliando diversos tipos de alimentos como leite e derivados, frutas, carne, vegetais e cereais (Zhou et al., 2023). A aplicação do modelo de digestão estática in vitro desenvolvido pelo consórcio internacional INFOGEST, demonstrou ser um padrão com os melhores resultados para humanos na simulação gástrica e intestinal. O protocolo adotado pelo método, engloba a etapa de simulação salivar, gástrica e intestinal, e inclui enzimas digestivas e fluidos de digestão simulados (Minekus et al., 2014), detalhes importantes que tornam a simulação mais precisa, e que garantem a análise nutrientes que vão além dos comumente analisados, como peptídeos, aminoácidos, ácidos graxos e açúcares simples (Brodkorb et al., 2019).
Entretanto, a aplicação desse protocolo na avaliação de dietas para animais, ainda é limitado. Apesar disso, estudos recentes têm buscado introduzir e adaptar a metodologia para essa finalidade, mas ainda em escala piloto, sem validação. Neste estudo piloto conduzido pelo nosso laboratório(Figura 1), foi comparado a digestibilidade in vivo e in vitro da matéria seca, matéria orgânica e proteína bruta, pelos métodos propostos por Hervera et al. (2007) com adaptações, o qual foi reduzido a quantidade de ração utilizada de 1,0 g para 0,75g, devido ao maior teor proteico presente em alimentos para felinos, e o método INFOGEST. Com base nos resultados obtidos, a matéria seca entre os dois métodos se aproximaram do valor in vivo (in vivo=83,47%; Hervera=86,6%; INFOGEST=79,41%), demonstrando a aplicabilidade das técnicas com resultados promissores e equiparáveis in vivo.
Avaliação da fermentação e microbiota intestinal:
A fermentabilidade in vitro para avaliação da funcionalidade intestinal de cães e gatos têm sido estudada há mais de 20 anos. Sunvold et al. (1995), foram pioneiros ao utilizarem inóculo fecal de cães e gatos para avaliação da fermentação in vitro de diversas fontes de fibras com diferentes potenciais de fermentação (alta, média e baixa fermentação). Embora o estudo da microbiota fecal ser um tema mais atual, esses autores já avaliavam a capacidade das comunidades bacterianas em fermentar substratos e produzir ácidos graxos de cadeia curta.
Em estudos mais recentes, como o desenvolvido por González et al. (2023), utilizando inóculo fecal de gatos, a fermentabilidade in vitro possibilitou a avaliação de variáveis correlacionadas à funcionalidade intestinal, como produção de gás, pH, amônia, ácidos graxos de cadeia curta e ramificada. Em humanos, os avanços metodológicos incluem modelos dinâmicos computadorizados capazes de simular diferentes etapas da fermentação gastrointestinal, incluindo a fermentação colônica dividida em fases de estabilização da microbiota e avaliação do efeito dos alimentos sobre essa microbiota estabilizada (Rosés et al., 2021). Apesar disso, os autores relataram limitações importantes, como a impossibilidade de simular a absorção de água e o longo período necessário para o processo de avaliação.
A avaliação in vitro da digestibilidade da dieta é uma etapa importante e decisiva para a avaliação da microbiota e fermentação in vitro, uma vez que determina o tipo e quantidade de substrato disponível para a fermentação microbiana. Uma vez que são três os principais sítios do trato gastrointestinal de cães e gatos que promovem a digestão de nutrientes (estômago, intestino delgado e intestino grosso), é importante que os métodos in vitro sejam compatíveis em representar os eventos fisiológicos que correm nestes sítios.
Embora os métodos estáticos atualmente usados para simular a digestibilidade total em cães e gatos apresentem resultados compatíveis, estes métodos não reproduzem fisiologicamente o que ocorre no animal, pois estes simulam apenas a etapa de digestão gástrica e do intestino delgado, com calibração na dose enzimática empregada, condições de pH e tempo de digestão, para se obter resultados semelhantes aos obtidos em animais. Com isto, a limitação atual é o desenvolvimento de métodos que sejam compatíveis com as 3 fases de digestão, gástrica, pancreática e fermentativa do cólon.
Neste sentido, em nosso laboratório temos adaptado o método INFOGEST seguido pela fermentação in vitro do substrato não digerido por este método (precipitado após a digestão) para se obter resultados compatíveis com a digestibilidade total obtida em animais. Desta forma, é possível reproduzir os resultados em animais com os métodos in vitro e ao mesmo tempo compreender como alimentos, nutracêuticos e nutrientes são transformados após a passagem em cada um destes compartimentos. Para isto, é necessário ajustar os métodos in vitro para que os resultados após a etapa fermentativa sejam compatíveis com os resultados in vivo, e atualmente estes métodos são ajustados para representarem os resultados in vivo, sem a etapa fermentativa, o que não permite uma melhor compreensão dos processos fisiológicos.
Neste sentido, estamos trabalhando ajustes no método INFOGEST, para se obter substrato ao final da etapa do intestino delgado, para ser introduzido na etapa in vitro de fermentação, com inóculo fecal de cães e gatos e ao final obter resultados de digestibilidade total compatíveis com os resultados em animais.
Em um estudo inicial, foram obtidos os seguintes resultados in vitro, para a digestibilidade parcial (simulação da digestibilidade ileal) e digestibilidade total (seguida pela fermentação in vitro), por ambos os métodos: in vivo, a digestibilidade da proteína bruta (DIV PB) foi de 87,11%, enquanto que o método in vitro de Hervera et al. (2007) a DIV PB foi de 88,93% e o desaparecimento total de 95,89%, e o método INFOGEST a DIV PB foi 47,01% e o desaparecimento total foi 86,77%.
É possível verificar que o método de Hervera et al. (2007) foi calibrado para que os resultados ao final da etapa gástrica e de digestão pancreática, já sejam compatíveis com o in vivo, uma vez que os resultados da DIV foram semelhantes ao in vivo, enquanto ao utilizar o substrato desta etapa para a fermentação, este método superestimou a digestibilidade total. Para o método INFOGEST, ocorreu o contrário, sendo a DIV da PB subestimada após a etapa pancreática, enquanto a digestão total após a etapa fermentativa foi compatível com a digestão in vivo. Estes resultados com ambos os métodos abrem perspectivas para a melhor padronização destas metodologias, visando simular as 3 etapas da digestão no animal.
Neste sentido, o INFOGEST apresenta vantagem, pois todo o método é padronizado para a atividade enzimática visando obter resultados entre laboratórios também compatíveis, uma vez que a maior limitação dos métodos in vitro é a não padronização das atividades enzimáticas empregadas. Com isto, os resultados do método INFOGEST mostraram-se promissores, mas ainda são necessários ajustes, uma vez que a etapa ileal foi provavelmente subestimada (47,01%), já que os poucos estudos em animais de companhia, demonstram que a digestibilidade nesta etapa, da PB, é em torno de (70-80%) em alimentos extrusados, conforme verificado por Hendriks et al. (2013). Desta forma, estamos trabalhando nos ajustes na relação substrato, enzima e condições do método para obter resultados mais compatíveis.
Estudo piloto da avaliação da microbiota por abordagem in vitro:
A respeito da etapa de fermentação in vitro, já tem sido demonstrado que este método fornece informações valiosas sobre produtos de fermentação em relação aos substratos utilizados. No entanto, as informações sobre modificações da dieta no microbioma intestinal, ainda são escassas pelos métodos in vitro. Neste sentido, um estudo piloto desenvolvido por nosso laboratório, teve como objetivo avaliar, a capacidade de obter informações a respeito da microbiota intestinal, a partir do método de fermentação in vitro proposto por González et al. (2023). Para isso, foram avaliados quatro alimentos completos formulados para gatos adultos, previamente caracterizados quanto aos seus efeitos sobre a microbiota fecal in vivo.
Inicialmente, foi preparado o substrato das dietas com base nas adaptações propostas por Volpato (2024). As dietas foram moídas e posteriormente, 0,75g de cada amostra foram pesados para ensaio. Na fase gástrica, o pH foi ajustado para 2, e adicionou-se pepsina, seguida de incubação por 2h em agitação constante. Em seguida, na fase intestinal, o pH foi ajustado para 6,8, e a pancreatina foi adicionada, mantendo-se as amostras incubadas por mais 4h. Ao final da digestão, adicionou-se ácido sulfossalicílico para interromper a atividade enzimática. Posteriormente, o resíduo não digerido foi filtrado, seco em estufa a 105°C e pesado. Esse resíduo foi então utilizado como substrato para a etapa de fermentabilidade in vitro. Após a fermentação, 2 mL da solução foram destinados à análise da microbiota fecal, sendo realizada a amplificação da região 16S rRNA seguida de análise por PCR, conforme metodologia empregada nas análises in vivo.
Como resultado, foi observado que a alfa-diversidade não demonstrou diferenças significativas entre as dietas in vivo e in vitro (Figura 2). Além disso, na comparação entre dietas, a dieta B apresentou uma estimativa maior em comparação a outras dietas em ambas as metodologias.
Quando avaliado a frequência relativa da composição da microbiota, foram encontrados gêneros bacterianos semelhantes entre ambos os métodos de avaliação, destacando-se a presença de Megasphaera, Blautia e Olsenella (Figura 3) em ambas as análises.
O gráfico de dispersão revela a aproximação entre os principais gêneros bacterianos encontrados na avaliação in vivo e in vitro. Com base nisso, gêneros como Magasphaera e Blautia demonstram diferença entre os métodos de apenas 1% (Figura 4, Tabela 1).
Tabela 1: % das médias dos gêneros bacterianos relativos in vivo e in vitro
| In vitro | In vivo | |
| Megasphaera | 15% | 14% |
| Bifidobacterium | 2% | 8% |
| Blautia | 4% | 5% |
| Prevotella | 13% | 1% |
| Olsenella | 8% | 17% |
| Bacteroides | 7% | 2% |
Resultados como estes, ainda que provenientes de estudos pilotos, demonstram que analises in vitro podem contribuir para obtenção de informações preliminares sobre diferentes alimentos, e seu possível impacto sobre a microbiota intestinal e os produtos de fermentação (Nissen et al., 2020).
Contudo, assim como observado em nosso estudo piloto recente avaliando a digestibilidade in vitro por diferentes metodologias, a forma de obtenção do substrato para a fermentação também pode impactar na avaliação da microbiota in vitro (Isenring et al., 2023). Para essa finalidade, diferentes métodos têm sido empregados na literatura. Butowski et al. (2022), por exemplo, optaram por determinar a microbiota fecal e produtos de fermentação de dietas para gatos utilizando o método do INFOGEST para obtenção do substrato, enquanto que Abbeele et al. (2020) utilizaram a incubação colônica, e Ren et al. (2025) avaliaram diferentes meios de cultura para fermentação. Além disso, outros métodos de digestibilidade in vitro podem ser empregados para gerar substratos, como o modelo semi-dinâmico proposto por Jadhav et al. (2023), que considera as variações do pH ao longo do processo. Além disso, deve-se levar em consideração na análise in vitro, que as amostras para avaliação da microbiota são congeladas imediatamente após a fermentação, em ambiente estéril, enquanto o in vivo tem uma tolerância de 15 minutos até o congelamento.
Conclusão
A avaliação da microbiota fecal felina in vitro demonstra ser um modelo promissor na avaliação de alimentos e ingredientes, principalmente podendo direcionar previsões sobre interação do alimento com a microbiota. Entretanto, para gatos ainda não há um consenso, assim como não há uma padronização do método. Dessa forma, ainda há necessidade de melhor padronização dos métodos in vitro para as etapas gástrica e ileal, visando obter a composição de substratos compatíveis para a sua introdução na etapa de fermentação in vitro. Estes estudos abrem horizontes ainda não experimentados na nutrição animal, com a possibilidade futura da substituição parcial ou total no uso de animais em pesquisa.
Referencias bibliográficas sob consulta junto ao autor