La importancia de los marcadores en la evaluación de probióticos

• No obstante, evaluar y predecir la salud intestinal es muy complejo y a menudo inexacto.

Aun así, los marcadores intestinales son necesarios para:

Predecir los problemas de rendimiento

Evaluar la eficacia de las estrategias de salud intestinal

Justificar las intervenciones de producción

Probar los cambios nutricionales y las nuevas herramientas de diagnóstico

En el campo se han utilizado varios marcadores relacionados con la salud intestinal para ayudar a supervisar el estado de salud de las aves de corral.

A pesar de ello, la eficacia de dichos marcadores sigue siendo discutida, principalmente debido a la dificultad de establecer criterios científicos y a los problemas para establecer una muestra ideal y estadísticamente aceptable.

Además, algunos de estos marcadores tienen una baja correlación directa con los parámetros.

Sin embargo, algunos marcadores han sido probados y utilizados exhaustivamente, lo que proporciona una mayor seguridad a los usuarios, sobre todo porque cuentan con una base científica probada.

• Entre dichos marcadores, los sistemas de puntuación macroscópica mediante necropsias, los análisis histopatológicos y morfométricos, el análisis de la microbiota y los metabolitos intestinales son metodologías que presentan una correlación positiva con el estado de salud intestinal de las aves.

El objetivo del presente artículo es revisar algunas metodologías de evaluación de la salud intestinal en aves de corral y plantear cómo se han comprobado los efectos del probiótico Alterion^®, una cepa exclusiva del Bacillus subtilis (29784), en la modulación de esos marcadores de salud intestinal.

Puntuaciones macroscópicas

En general, la evaluación y clasificación mediante puntuaciones macroscópicas se realiza tras la muerte o el sacrificio de los animales enfermos. Ahora bien, en avicultura, la realización de necropsias con el fin de controlar el estado de salud es habitual y de extrema importancia para el diagnóstico y el control de las enfermedades.

Se pueden observar varias metodologías de puntuación en el campo. Sin embargo, la metodología publicada por Teirlynck y colaboradores (2011) demostró ser sencilla de aplicar y fácil de controlar.

Además, el sistema de puntuación de las lesiones macroscópicas mostró una correlación negativa en relación con la longitud de las vellosidades y una correlación positiva con la infiltración de linfocitos T en situaciones de disbacteriosis (Figura 1a y 1b).

Figura 1a. Correlación de la puntuación macroscópica con la longitud de las vellosidades y el infiltrado de linfocitos T

Longitud de las vellosidades (μm) en cortes duodenales (Y) en relación con la puntuación macroscópica (X)

Figura 1b. Correlación de la puntuación macroscópica con el infiltrado de linfocitos T

Infiltración de linfocitos T (porcentaje de área) en secciones duodenales y cecales (Y) en relación con la puntuación macroscópica

Utilizando la metodología de Teirlync y colaboradores se realizó una prueba con desafío nutricional mediante la inclusión de un 20% de centeno, induciendo un aumento en el contenido de PNA (polisacáridos no amiláceos) de las dietas, y posteriormente se evaluaron los efectos del probiótico Alterion^® (Bacillus subtilis 29784).

La puntuación de la enteritis bacteriana se redujo a 1,0 en los animales del grupo Alterion^®, mientras que los animales del grupo de control (sólo desafiados con PNA) mantuvieron una puntuación de 2,0 (Figura 2).

Este estudio demostró que es posible verificar los efectos del probiótico Alterion® mediante una metodología de evaluación de puntuación macroscópica.

Figura 2: Alterion^® (Bs 29784) disminuye la puntuación macroscópica en pollo de engorda desafiado con altos niveles de polisacáridos no amiláceos (PNA)

Se han desarrollado algunas metodologías para facilitar una evaluación histológica mediante la aplicación de sistemas de puntuación para diferentes parámetros de la mucosa intestinal, por ejemplo:

• el grosor de la lámina propia
• el grosor epitelial
• la proliferación de enterocitos
• el infiltrado de células inmunes
• la proliferación de células de Globet
• la presencia de ooquistes (Kraieski et al., 2017; Belote et al., 2018, 2019).

De hecho, las evaluaciones histomorfológicas del intestino pueden ayudar a evaluar la integridad epitelial y la inflamación (Gholamiandehkordi et al., 2007).

Además, algunos estudios asocian el aumento de la altura de las vellosidades, el grosor de la lámina propia y la cantidad de células epiteliales con un mayor peso corporal de las aves (Kraieski et al., 2017).

En los estudios realizados con el probiótico Alterion^®, observamos un aumento significativo de la longitud de las vellosidades en comparación con el grupo de control (sin aditivos para la salud intestinal) en:

• íleon (control = 0,66 μm; Alterion^® = 0,79 μm, P<0,05)
• ciego (control = 1,25 μm; Alterion® = 1,46 μm, P<0,05).

La tabla 1 resume los resultados encontrados (Jacquier et al., 2019).

Tabla 1: Morfología de íleon y ciego en pollos de engorda de 42 días suplementados con Alterion^® (Tabla adaptada de Jacquier et al., 2019).

a, b significa dentro de una línea sin diferencia sobrescrita normal (P <0,05).EEM= error estándar de la media

No obstante, sabemos que los simples análisis morfométricos no son suficientes para evaluar el estado de integridad del epitelio intestinal.

• De este modo, la adición de evaluaciones histológicas a través de puntuaciones de diferentes parámetros ayuda en el análisis de la estructura epitelial. De hecho, utilizando la metodología publicada por Kraieski et al. (2017), denominada ISI (I See Inside), observamos que el probiótico Alterion^® disminuyó la puntuación ISI cuando se comparó con el grupo control negativo (sin aditivos) y el grupo de antibióticos (enramicina 10 ppm) en aves desafiadas bajo un modelo experimental de enteritis necrótica (Figura 3 y 4).

En concreto, destaca la disminución del grosor de la lámina propia y del epitelio de la mucosa, así como la disminución del infiltrado inflamatorio en estas dos regiones (Figura 3; Tirano et al., 2019).

Figura 3: Efectos de Alterion® en la puntuación microscópica del ISI en pollo de engorda de 14 días desafiado bajo el modelo de enteritis necrótica

1º imagen: Control (Desafiado sin aditivos); 2a imagen: Desafiado+Alterion; 3a imagen: Desafiado+Enramicina. EPT: Espesor epitelial; LPT: Espesor de la lámina propia; OOC: Ooquistes; PROL: proliferación de enterocitos; TOT: Puntuación total. Letras diferentes en cada parámetro indican diferencias estadísticas (p<0.05).

Figura 4: Alterion® disminuye la puntuación ISI en pollo de engorda desafiado con enteritis necrótica

Leyenda: Control: Desafiado; Alterion: Desafiado + Alterion®; Enramicina: Desafiado + Enramicina. La menor puntuación total observada en el grupo que consumió Alterion® indica una menor inflamación y una estructura de la mucosa intestinal más intacta.

Microbiota intestinal

El análisis de la microbiota intestinal de las aves sigue siendo considerado como una herramienta compleja y de poca utilidad en la rutina diaria de la industria avícola.

• Sin embargo, esta tecnología se ha popularizado y varios estudios han observado importantes correlaciones con la salud intestinal y los índices zootécnicos.

La microbiota puede clasificarse como resistente cuando la población microbiana tiene una mayor diversidad y un mayor número de bacterias con propiedades antiinflamatorias (bacterias productoras de butirato como Ruminococcaceae spp y Lachnospiraceae spp) y menos patógenos oportunistas como Clostridium perfringens y Enterobacteriaceae spp, así como Salmonella spp y Escherichia coli.

Varios estudios han demostrado los beneficios de ampliar los Firmicutes o de aumentar la proporción Firmicutes/Bacteroidetes.

Entre los Firmicutes productores de butirato, destaca la disminución de la población de Faecalibacterium prausnitzii, que demuestra ser un marcador importante en situaciones patógenas específicas.

• De hecho, Faecalibacterium prausnitzii presenta propiedades antiinflamatorias, en parte relacionadas con la secreción de metabolitos que bloquean la activación del factor de transcripción nuclear kB (NF-kB) y la secreción de interleucina 8 (IL-8) (Sokol et al., 2008).

En un modelo de desafío de enteritis necrótica, se observó la capacidad del probiótico Alterion^® para aumentar la diversidad alfa de la microbiota intestinal (índice de Chao y Shannon) en comparación con el grupo control (sin aditivos).

También se observó una mayor prevalencia de Ruminococcaceae (P>0,001 – Tabla 2) con la suplementación de Alterion^®, concretamente un aumento de Faecalibacterium prausnitzii (+13,4%; P<0,001). Como se ha comentado, esta bacteria se ha correlacionado con parámetros de salud intestinal como la longitud de las vellosidades y el área de linfocitos CD3.

Además, observamos un aumento de la prevalencia de bacterias del género Ruminococcus y Lachnoclostridium (Tabla 2), que son responsables de la descomposición del ANP en ácidos grasos de cadena corta, como el butirato (una molécula importante en la regeneración del epitelio y con efectos antiinflamatorios).

En otro experimento en el que pollos de engorda fueron desafiados con C. perfringens, se observó que el número de E. coli en el día 21 y el número de C. perfringens en el día 28 de vida de las aves se redujo significativamente en el grupo que consumió el probiótico.

Figura 5: Diversidad de la microbiota en muestras de contenido cecal de pollos de engorda suplementados con Alterion^® (adaptado por Keerqin et al., 2021)

Control: Control sin desafío/aditivo; EN: Desafío enteritis necrótica; Alterion^® + EN: Alterion^® + Enteritis Necrótica; Atb + EN: antibiótico promotor + enteritis necrótica.

Tabla 2: Efectos del probiótico Alterion^® en la microbiota del ciego (tabla adaptada por Jacquier et al. 2019; Poultry Science 98:2548-54).

Bacterias de las familias Lachnospiraceae y Ruminococcaceae están relacionados con la producción de butirato, una molécula implicada en la modulación de la inflamación intestinal y la reepitelización. La disminución del género Bacteroides, está relacionada con un aumento de la proporción Firmicutes/Bacteroidetes (grupo control=1.66; grupo Alterion^®=3.17) que se ha asociado al aumento de peso de las aves de corral (Jacquier et al., 2019).

Metabolitos microbianos

Por último, no podemos olvidar los metabolitos microbianos, los cuales pueden también estar relacionados con la salud intestinal.

Como se ha mencionado anteriormente, las bacterias de la microbiota convierten los carbohidratos complejos (como los PNA), la fibra e incluso las proteínas en una serie de metabolitos que tienen diversos efectos en la salud de los animales.

• Un ejemplo ya mencionado sería la transformación de los PNA que da lugar predominantemente a la producción de ácidos grasos de cadena corta como el butirato y el propionato.

Otros metabolitos están asociados a la integridad intestinal, como la hipoxantina, el pantotenato y el ácido nicotínico, que están estrechamente relacionados con el control de los procesos inflamatorios y la restauración de los tejidos.

• El ácido nicotínico (niacina) activa el receptor GPR109A (un tipo de receptor nicotínico) en el epitelio intestinal, suprimiendo la inflamación local (Singh et al., 2014).

Figura 6: El ácido nicotínico modula la inflamación en el intestino de las aves (adaptado por Singh et al. 2014; Immunity. 16; 40(1): 128-139).

Se ha demostrado que el ácido nicotínico aumenta la proliferación de enterocitos y la “cicatrización” epitelial en un modelo in vitro con células CaCo₂.

• Además, observamos que la suplementación con el probiótico fue capaz de aumentar los niveles de ácido nicotínico en el lumen del íleon y el yeyuno del pollo de engorda de 13 días (P<0,01), revelando uno de los mecanismos de acción de Alterion^® en la salud intestinal de las aves de corral (Figura 7).

Figura 7: Contenido de ácido nicotínico en el íleon y el yeyuno de pollo de engorda suplementado o no con Alterion^®

Se han desarrollado numerosas tecnologías moleculares para apoyar la comprensión de la salud intestinal, como la metagenómica, la metabolómica, el metatranscriptoma, etc.; actualmente forman parte de la línea de investigación de numerosos grupos de investigación y empresas en el campo de la avicultura.