Investigación

Importancia de las células intestinales . Estudios de IPEC

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Las líneas celulares continuas son uno de los modelos más usados y útiles para estudiar el efecto de factores específicos

 
Básicamente existen dos tipos de cultivos celulares: (a) de células primarias y (b) de líneas celulares continuas.
 
Las células primarias se aíslan directamente de un sujeto con una vida limitada
Las líneas celulares continuas, también referidas como establecidas o inmortales, tienen la habilidad adquirida de proliferar infinitamente.
 
 
Hay varios medios para conseguir la inmortalidad  de  una  línea  celular:  las células tumorales y las indiferenciadas son inherentemente inmortales, pero las células normales también pueden ser inmortalizadas (ser dotadas de habilidad tumoral) mediante la introducción de genes externos con un virus.
 
 
Las líneas celulares continuas se  utilizan  para estudiar  los  efectos  (por  ejemplo  de  aditivos alimentarios,fármacos y microorganismos) sobre un tipo celular específico (células epiteliales, linfocitos, fibroblastos) al más básico nivel.
 
Las células se siembran en una placa, se cultivan y se mantienen a una temperatura, con una mezcla de gases y en un medio de cultivo,apropiados.
 
Las IPEC-J2 son una línea celular no­ transformada de células epiteliales aisladas de un lechón acabado de nacer, que se han usado, y aún se usan, como modelo para desafíos con patógenos,como Salmonella,E.coli y otros.
 
En este artículo se explica el uso dela línea celular IPEC-J2 como modelo de estudio para ingredientes de la dieta y aditivos para esas situaciones de desafío (por agentes infecciosos).
 
 

¿Qué son las IECs?

 
La superficie del epitelio intestinal supone una área de aproximadamente 100m2• Consiste en una única capa de células epiteliales columnares (IECs) que separa la luz intestinal del espacio externo del tejido del hospedador.
 
  • Las IECs están implicadas en múltiples funciones digestivas, como la absorción de nutrientes y agua,el intercambio de electrolitos y la producción de hormonas.
 
Por esta permanente exposición al ambiente externo,las IECs son claves en el mantenimiento de la integridad del epitelio intestinal y en la reducción del riesgo de invasión por agentes externos,formando una barrera física.
 

Figura 1 .Células IPEC-J2 fijadas a la superficie de una placa-cubet

 
También son cruciales en el mantenimiento de la  homeostasis interna. Las  células  epiteliales
intestinales contribuyen a la barrera física por dos estructuras epiteliales (los microvillí ylas tight junctionsl que separan el ambiente externo  del organismo, previniendola invasión por microorganismos.
 
Las IECs también secretan una gran variedad de péptidos antimicrobianos, citoquinas y quimioquinas que se activan en situaciones patológicas o infecciosas fomentandola respuesta inflamatoria.
 

Por esta permanente exposición al ambiente externo,las IECs son claves en el mantenimiento de la integridad del epitel ointestinal y en la reducción del riesgo de invasión por agentes externos,formando una barrera física.

 

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También son cruciales en el mantenimiento de la  homeostasis interna. Las  células  epiteliales intestinales contribuyen a la barrera física por dos estructuras epiteliales (los microvillí y las tight junctionsl que separan el ambiente externo  del organismo, previniéndola invasión por microorganismos.

Las IECs también secretan una gran variedad de péptidos antimicrobianos, citoquinas y quimioquinas que se activan en situaciones patológicas o infecciosas fomentandola respuesta inflamatoria.

 
Durante una infección,cuando un patógeno rompe la mucosa intestinal,es reconocido por un receptor tipo tell (TLRs).
 
LosTLR se expresan a nivel de la superficie  intestinal y juegan  un rol clave en la respuesta inmune innata,pues activan la respuesta celular.
 
Entre las IEC están las células caliciformes que secretan mucus. Este mucus contiene mucinas que forman una barrera permeable que protege y repara el epitelio intestinal de cualquier daño. Las mucinas también pueden interactuar con las bacteriasy presentan la habilidad de inmovilizarlas y eliminarlas mediante los movimientos del intestino.
 

 

Líneas de células intestinales

 
 
La mayoría de investigaciones han sido realizadas en líneas celulares intestinales humanas derivadas de un cáncer de colon (por ejemploHT-29, T84, Caco-2) o de duodeno (HUTU-80). Pero también en líneas células intestinales pequeñas de rata (por ejemplo iEC-6 y iEC-18), las cuales no son cancerosas.
 
Sin embargo, la estructura y la función del tracto gastrointestinal de los roedores parece diferir del de otros mamíferos domésticos como el cerdo.
 
A día de hoy disponemos de tres líneas celulares epiteliales intestinales porcinas distintas:
 
  • La línea celular IPI-2I fue aislada de tejido ileal de un verraco adulto y fue transformada con un plásmido que inmortaliza las células.
  • La línea celular IPEC-1 fue aislada de una mezcla de tejidos de íleon y yeyuno de lechón de un día. Son una línea celular no transformada.
  • La línea celular IPEC-J2 fue aislada de tejido yeyunal de lechón de un día y también es una línea celular no transformada
 

Figura 2. Función barrera de las IECs (J.R. Turner, 2008)

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La falta de líneas celulares epiteliales intestinales no derivadas de tumores y la especificidad para porcino establece la importancia de la línea celular iPEC-J2, además de considerar que puede soportar adecuadamente infecciones de una gran variedad de microorganismos.
 
Se ha demostrado que los resultados obtenidos en estudios realizados con la línea celular IPEC-j2 pueden ser trasladados a estudios con el animal (cerdo) entero.
 
 

Cómo se ven afectadas las IPEC

 
 
La línea celular IPEC-J2 constituye un excelente modelo para las interacciones de estos patógenos con el epitelio intestinal porcino y es usada frecuentemente desde su caracterización realizada por Shierack et al., 2006.
 
Antes de su caracterización, las células IPEC-J2 se usaban como modelo de la enteropatía proliferativa porcina (Lawsonia intracellularis), pues la bacteria penetra y prolifera en ellas, como también se ha observado en desafíos con Chlamydia.
 
Cuando Shierack et al., 2006, caracterizaron las células IPEC-J2, demostraron que las IPEC también soportan la invasión con diferentes especies de Salmonella y la adhesión de E. coli.
La habilidad de estas bacterias para inducir una respuesta infamatoria e inmune (por ejemplo mediante la expresión de citoquinas y TLRs)  ha sido repetidamente demostrada en subsiguientes estudios con las IPEC-J2.
 
También se ha mostrado que la permeabilidad de la monocapa de IPEC-J2 (medida con resistencia eléctrica transepitelial; TEER) se ve reducida por Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC).
 
Escherichia coli, Salmonella  y  Chlamydia  son patógenos mayores en la industria porcina, además de ser representativos con estrategias de infección muy diferenciadas. ésta es una de las principales razones por las que la línea celular IPEC-J2 constituye un excelente modelo para las interacciones de estos patógenos con el epitelio intestinal porcino.
Las toxinas ETEC han sido completamente estudias en lasIiPEC-J2, su rol en la adherencia bacteriana ha sido presentado por Johnson et al., 2009. La adherencia es un punto clave, pues para las ETEC es un prerrequisito previo a la colonización.
 
 

Figura 3. Salmonella puede invadir las células epiteliales (paso 1). Esta infección intracelular lleva a una respuesta inflamatoria local (paso 2) mediada por neutrófilos (paso 3), con la consecuente lesión tisular y desprendimiento epitelial (paso 4). (González-Escobedo et al., 2011)

 
 
 
Más recientemente, las células IPEC-J2 se usaron para demostrar como altas concentraciones de desoxinivalenol, una toxina producida por hongos del género Fusarium, reducía la viabilidad de las células epiteliales intestinales porcinas.
 
Esto es interesante en nutrición porcina puesto que el desoxinivalenol a menudo contamina el grano de cereales, causando diarrea y pérdida de peso en cerdos.
 Captura-IPEC5
Las células IPEC-J2 han visto aumentado su uso en el estudio de potencial probiótico de microorganismos, focalizándose o bien en su potencial adherente a la línea celular IPEC-J2 o en la habilidad del probiótico para inhibir la respuesta inflamatoria inducida por un patógeno específico.
 
Algunos ejemplos de estos probióticos son cepas de Enterococcus, Saccharomyces o múltiples especies de Lactobacillus. La validez de estos estudios aún está por confirmar, puesto que los artículos de las pruebas in vivo aún no se han publicado.
 
En una publicación reciente, algunos ingredientes (salvado de trigo, glicomacropéptido de caseína, oligosacáridos manano, extracto de garrofín, y extracto de la fermentación de Aspergillus oryzae) fueron capaces de reducir la adhesión de ETEC a las IPEC-J2, e interferir en la respuesta inflamatoria innata.
 
Otro estudio demuestra como el  ácido  fítico redujo los efectos  negativos  del  desoxinivalenol en la integridad de la membrana de la línea celular epitelial intestinal.
 
Entre los distintos ingredientes de la dieta y aditivos usados en los estudios con IPEC, debemos prestar especial atención a aquellos relacionados con el uso y la influencia del zinc en el epitelio intestinal.
 
 

Figura 4. Resumen de las citoquinas y quimioquinas producidas por las IECs

 
 

Dosis y fuente de zinc

 
 
El uso de óxido de zinc en el alimento a dosis farmacológicas (ZnO, 2500-3000ppm) está ampliamente aceptado en la industria porcina para reducir la incidencia y la severidad de la diarrea post-destete de los lechones, en particular la causada por ETEC K88. Sin embargo, el mecanismo terapéutico no se comprende del todo.
 
En un primer estudio in vitro realizado con la línea celular intestinal humana Caco-2, se demostró que incrementar las concentraciones de ZnO reducía la adhesión de ETEC K88 y su internalización en la línea celular.
 
También se observó que el ZnO previene el incremento de permeabilidad de las tight junction inducida por ETEC y la expresión de distintos genes de respuesta inflamatoria, también inducida por ETEC y la expresión de distintos genes de respuesta inflamatoria, también inducida por ETEC.
 

Figura 5. Reducción de la adhesión de ETEC a las células IPEC-J2

 
 
Las células IPEC-J2 se usaron en un modelo in vitro de infección intestinal con ETEC, con y sin suplementación con ZnO.
 
El análisis genómico identificó incrementos en la expresión de distintos genes de respuesta inmune innata (como citoquinas) en respuesta a la exposición a ETEC, pero se redujo cuando las células fueron simultáneamente expuestas al ZnO.
 
Los efectos metabólicos mostraron que el ZnO puede modificar la morfología celular IPEC-J2 a bajas concentraciones, y que reduce la viabilidad celular a mayores valores.
 
Cuando la adhesión de las ETEC a la célula del huésped se midió tan solo 2 horas después, la suplementación con ZnO no mostró ningún efecto.Sin embargo, cuando se midió en un periodo más largo, el ZnO a concentraciones que no afectaban la morfología de las IPEC-J2 redujeron la adhesión de ETEC.
 
 
Este estudio no mostró ningún efecto antimicrobiano del ZnO, proveyendo mecanismos alternativos para la reducción de la incidencia de diarrea post-destete en cerdos suplementados con ZnO.
 
Sin embargo, como ya se ha señalado, la Caco-2 es una línea celular intestinal humana, mientras que ETEC K88 es un patógeno específico porcino.
 
Algunos estudios recientes investigaron el efecto de la dosis y la fuente de ZnO en células IPEC -J2 desafiadas con ETEC con el fin de acercarse al un mejor modelo de investigación porcino.
 
Estos hallazgos sugieren que la dosis y la fuente de ZnO tienen un impacto significativo tanto en las IPEC-J2 como en el metabolismo del patógeno, reduciendo también la expresión de genes inflamatorios cuando se desafía IPEC-2.
 
 

Conclusiones

 
  • Las células epiteliales intestinales son la primera línea  de  defensa  frente  al  ambiente  externo y tienen un rol importante  en  la  respuesta inflamaoria.

  • El uso de líneas celulares epiteliales como modelo in vitro ha ido ganando popularidad los últimos años.

  • La línea celular IPEC-J2 representa un buen modelo específi o porcino para el estudio del efecto de ingredientes de la dieta en la respuesta inflamatoria causada por patógenos porcinos específicos.

  • El uso de IPEC-J2 y de otras líneas celulares crecerán en el futuro, ofreciendo un modelo excelente para investigar el mecanismo terapéutico del ZnO

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