A importância dos marcadores de saúde intestinal para avaliação de probióticos

a, b significa dentro de uma linha sem uma diferença sobrescrita comum (P <0,05). EPM= erro padrão da média.

Entretanto, sabemos que apenas análises morfométricas simples não são suficientes para avaliar o status de integridade do epitélio intestinal. Dessa maneira, acrescentar avaliações histológicas através de scores de diferentes parâmetros, auxiliam na análise da estrutura epitelial. De fato, com o uso da metodologia publicada por Kraieski et al. (2017), denominada ISI (I see inside), observamos que o probiótico Alterion® diminui o escore ISI quando comparado com o grupo controle negativo (sem aditivos) e o grupo antibiótico (enramicina 10 ppm) em aves desafiadas em modelo experimental de enterite necrótica (Figura 3 e 4).
Especificamente, podemos destacar a diminuição na espessura da lâmina própria e no epitélio da mucosa, e ainda a diminuição no infiltrado inflamatório nessas duas regiões (Figura 3 – Tirano et al.,2019). Esses dados reforçam o potencial do probiótico analisado em melhorar a integridade e modular a inflamação epitelial em situações com ou sem desafio.
Figura 3: Efeitos de Alterion® sobre escore microscópico ISI em frangos de corte de 14 dias desafiados em modelo de enterite necrótica.

1º imagem: Controle (Desafiado sem aditivos); 2º imagem: Desafiado+Alterion; 3º imagem: Desafiado+Enramicina. EPT: Espessura epitelial; LPT: Espessura de lâmina própria; OOC: Oocistos; PROL: proliferação de enterócitos; TOT: Escore total. As letras diferentes em cada parâmetro indicam diferenças estatísticas (p<0.05).

Figura 4: Alterion® diminui o escore ISI em frangos de corte em desafio de enterite necrótica.

Controle: Desafiado; Alterion: Desafiado + Alterion®; Enramicina: Desafiado + Enramicina. O menor escore total observado no grupo que consumiu Alterion® indica menor inflamação e estrutura da mucosa intestinal mais íntegra.

MICROBIOTA INTESTINAL
A análise da microbiota intestinal das aves ainda é classificada como uma ferramenta complexa e de pouco uso no dia a dia da indústria avícola. Entretanto, essa tecnologia vem se popularizando e, diversos trabalhos vem observando correlações importantes com saúde intestinal e índices zootécnicos.

Avaliar a microbiota intestinal sob uma perspectiva ecológica poderia fornecer conhecimento em como promover a saúde através da nutrição, modulando comunidades microbianas específicas.

A microbiota pode ser classificada como resiliente quando a população microbiana apresenta maior diversidade e maior número de bactérias com propriedades anti-inflamatórias (bactérias produtoras de butirato como Ruminococcaceae e Lachnospiraceae) e menor número de patógenos oportunistas como Clostridium perfringens e Enterobacteriaceae como Salmonella e Escherichia coli. Diversos estudos vêm mostrando os benefícios da expansão de Firmicutes ou aumento da razão Firmicutes/Bacteroidetes. Dentro dos Firmicutes produtores de butirato, a diminuição da população de Faecalibacterium prausnitzii se destaca, mostrando ser um importante marcador em situações patogênicas específicas.

De fato, Faecalibacterium prausnitzii exibe propriedades antiinflamatórias, em parte relacionada com a secreção de metabólitos que bloqueiam a ativação de fator de transcrição nuclear kB (NF-kB) e a secreção de Interleucina 8 (IL-8) (Sokol et al. 2008).
Em um modelo de desafio de enterite necrótica, foi observada a capacidade do probiótico Alterion® em aumentar a alpha diversidade da microbiota intestinal (índice de Chao e Shannon) quando comparado com as aves do grupo controle (sem aditivos). Também foi observado maior prevalência de Ruminococcaceae (P>0.001 – Tabela 2) com a suplementação de Alterion®, especificamente aumento da Faecalibacterium prausnitzii (+13.4%; P<0.001). Como comentado, essa bactéria vem sendo correlacionada com parâmetros de saúde intestinal como comprimento de vilosidades e área de linfócitos CD3.
Além disso, observamos um aumento na prevalência de bactérias do gênero Ruminococcus e Lachnoclostridium (Tabela 2), que são responsáveis pela quebra de PNA em ácidos graxos de cadeia curta, como o butirato (molécula importante na reepitelização e efeitos anti-inflamatórios). Em um outro experimento onde frangos de corte foram desafiados com C. perfringens, observamos que o número de E. coli no dia 21 e o número de C. perfringens no dia 28 de vida das aves foram reduzidos significantemente no grupo que consumiu o probiótico.

Figura 5: Diversidade da microbiota em amostras de conteúdo cecal de frangos de corte suplementados com Alterion® (adaptado de Keerqin et al., 2021).

Controle sem desafio/aditivo; EN: Desafio enterite necrótica; Alterion + EN: Alterion® + Enterite Necrótica; Atb + EN: antibiótico promotor + enterite necrótica.

Tabela 2: Efeitos do probiótico Alterion® sobre a microbiota de ceco (tabela adaptada de Jacquier et al. 2019; Poultry Science 98:2548-54).

Bactérias das famílias Lachnospiraceae e Ruminococcaceae estão relacionadas com a produção de butirato, molécula envolvida na modulação da inflamação intestinal e reepitelização. A diminuição do gênero Bacteroides, está relacionada com aumento da relação Firmicutes/Bacteroidetes (grupo controle=1.66; grupo Alterion®=3.17) que vem sendo associada com aumento de peso de aves (Jacquier et al., 2019).
METABÓLITOS MICROBIANOS
Finalmente, não podemos esquecer dos metabólitos microbianos, que também podem ser relacionados a saúde intestinal. Como citado anteriormente, bactérias da microbiota convertem complexos de carboidratos (como PNA), fibras e até mesmo proteínas em uma variedade de metabólitos que apresentam diversos efeitos na saúde dos animais. Um exemplo já comentado seria a metabolização de PNA resultando predominantemente na produção ácidos graxos de cadeia curta como butirato e propionato.
Outros metabólitos estão associados a integridade intestinal, como é o caso das hipoxantina, pantotenato e ácido nicotínico, que estão intimamente relacionados com controle de processos inflamatórios e restauração tecidual. O ácido nicotínico (niacina) ativa o receptor GPR109A (um tipo de receptor nicotínico) no epitélio intestinal, suprimindo a inflamação local (Singh et al.,2014).
Figura 6: O ácido nicotínico modula a inflamação no intestino de aves (adaptado de Singh et al. 2014; Immunity. 16; 40(1): 128–139).

Foi demonstrado que o ácido nicotínico aumenta a proliferação de enterócitos e a “cicatrização” epitelial em um modelo in vitro com células Caco-2. Ainda, observamos que a suplementação com o probiótico foi capaz de aumentar os níveis de ácido nicotínico no lúmen do íleo e jejuno de frangos de corte com 13 dias de vida (P <0.01); revelando um dos mecanismos de ação do Alterion® sobre a saúde intestinal de aves (Figura 7).
Figura 7: Teores de ácido nicotínico em íleo e jejuno de frangos de corte suplementados ou não com Alterion®.

Inúmeras tecnologias moleculares vêm sendo desenvolvidas para apoiar o entendimento da saúde intestinal como metagenômica, metabolômica, metatranscriptoma, etc; sendo essas, atualmente parte da linha de pesquisa de inúmeras grupos de pesquisas e empresas da área de avicultura; porém, em função da complexibilidade do intestino das aves, a replicação dessas metodologias na realidade de campo é um grande desafio dos profissionais da avicultura.