Visualización de la germinación de Bacillus subtilis

Aurélie MOAL, Global Marketing Manager, Health By Nutrition, Adisseo

Estelle DEVILLARD, PhD, R&D Manager, Health by Nutrition, Adisseo

Karoline SIDELMANN BRINCH, DVM, PhD, Science Manager, Novozymes Applied Research, Animal Health and Nutrition

El uso de probióticos, como los Bacilli, ha aumentado considerablemente en los últimos 25 años en la producción animal.

Los probióticos son bacterias vivas que cuando se administran en una cantidad adecuada confieren efectos fisiológicos beneficiosos al huésped, lo que resulta en una mejora de la salud y del rendimiento de los animales.

Las células del género Bacillus tienen dos formas morfológicas distintas, en función de las condiciones ambientales:

› Endospora (o espora)

› Célula vegetativa

Los bacilos se suplementan a los animales como esporas que son capaces de soportar duros procesos de fabricación del alimento y un almacenamiento prolongado.

Las esporas ….

› Son metabólicamente inactivas

› Se forman en respuesta al estrés ambiental como mecanismo de supervivencia.

› Son la forma no reproductiva de las bacterias

› Son la estructura biológica viable más duradera conocida.

› Son robustas y pueden sobrevivir a la radiación UV, a temperaturas extremas, a la presión, a la exposición química tóxica y a la acidez.

Cuando se genera una señal suficientemente fuerte, comienza la germinación. Los receptores también pueden ser inhibidos, pero una vez que se activan por completo, la germinación es irreversible.

» A diferencia de las esporas, las células vegetativas se dividen, se multiplican, se comunican y son móviles.

» Son metabólicamente activas y producen metabolitos que son los responsables de proporcionar los efectos beneficiosos del probiótico al huésped.

Para la mayoría de las cepas de Bacillus la capacidad de germinar y crecer in vivo sigue siendo desconocida.

Como resultado del sofisticado proceso de germinación, especialmente en un entorno tan complejo como el lumen del tracto digestivo, la confirmación in vivo de la germinación sigue siendo una misión difícil.

La germinación y el crecimiento de Bacillus subtilis DSM 29784 se han investigado en detalle, utilizando una serie de métodos complementarios, como:

› Ensayos in vitro

› Tecnologías de fluorescencia

› Evaluación de metabolitos in vivo

La cepa Bacillus subtilis DSM 29784 fue seleccionada por sus capacidades superiores de germinar en medios que simulaban diversos escenarios de condiciones intestinales y dietas.

⇒ Cultivo in vitro con compuestos alimenticios y aditivos

En un estudio preliminar, Bacillus subtilis DSM 29784 se cultivó in vitro, junto con una serie de compuestos alimenticios y aditivos, para evaluar el impacto del medio en la velocidad de germinación mediante densidad óptica (DO).

› El perfil de germinación de Bacillus subtilis DSM 29784 fue similar a lo largo del tiempo en caso de suplementación de trigo, maíz y soja.

› Además, la inclusión de ácidos orgánicos, coccidiostáticos y diversos aditivos no mostró ningún impacto sobre la germinación.

⇒ Cultivo in vitro comparando con otras cepas de Bacillus

› La cinética de germinación de Bacillus subtilis DSM 29784 también se comparó in vitro en condiciones similares con otras cepas de Bacillus, en concreto un Bacillus subtilis y un Bacillus licheniformis.

› Se observó que la cinética de germinación varía notablemente entre cepas, siendo Bacillus subtilis DSM 29784 claramente superior en cuanto a patrón de germinación (Figura 1).

La germinación de Bacillus subtilis DSM 29784 se observó mediante el desarrollo de un sistema único e innovador de doble indicador fluorescente que rastrea el proceso de germinación en el intestino del ave.

Se realizaron tres pasos:

» Integración de los marcadores fluorescentes en el genoma de Bacillus subtilis DSM 29784.

Más específicamente en dos genes, uno que codifica para la proteína fluorescente verde (GFP) que expresa una señal luminosa verde si la bacteria se encuentra en su forma de espora, y otro que codifica para la proteína fluorescente roja (dsRed), cuya luminiscencia roja se observa para la forma vegetativa.

» Contraste de fluorescencia mediante análisis de microscopía.

Se inoculó una placa de 96 pocillos con esporas de Bacillus subtilis DSM 29784 y se observó la

fluorescencia en diversos momentos, como se muestra en la Figura 2. Las esporas latentes de Bacillus subtilis DSM 29784 transmiten una fluorescencia verde que desaparece rápidamente tras la germinación, dando paso a una fluorescencia roja para las células germinadas.

» Visualización la germinación en el intestino del ave.

Se realizó una prueba de 13 días para comprobar la germinación de Bacillus subtilis DSM 29784 in vivo.

Los pollos de engorde fueron alimentados a las 72 horas antes del sacrificio con una dieta control o con una dieta enriquecida con esporas de Bacillus subtilis DSM 29784 marcado.

Al final del estudio, se obtuvieron muestras de contenido ileal de los pollos, se analizaron y procesaron a través de un analizador InCell para observar la fluorescencia.

El color rojo (Figura 3) indicó que la mayoría de las esporas habían germinado y estaban creciendo activamente, hecho que respalda los efectos beneficiosos sobre la salud del animal.

Un enfoque complementario que puede usarse para investigar la actividad in vivo de Bacillus subtilis DSM 29784, después de la germinación y el crecimiento, es controlar la producción de metabolitos.

Los metabolitos de Bacillus subtilis DSM 29784 se estudiaron en primer lugar in vitro y se identificaron tres metabolitos producidos en cantidades altas y consistentes (niacina, pantotenato e hipoxantina).

Sucesivamente, la concentración de estos metabolitos se midió en el contenido digestivo de las aves que habían recibido Bacillus subtilis DSM 29784.

Además, se confirmó que la actividad de Bacillus subtilis DSM 29784 es mayor en las partes superiores del intestino, lo que refuerza los datos obtenidos en el estudio de germinación.

La actividad metabólica de Bacillus subtilis DSM 29784 en el intestino respalda los efectos beneficiosos in vivo sobre el rendimiento, la salud y la microbiota del huésped (Jacquier et al. 2019).

Una vez germinado y activado, Bacillus subtilis DSM 29784 refuerza la resiliencia de un animal actuando a través de tres líneas de defensa íntimamente conectadas:

› Estimular un microbioma resiliente

› Fortalecer la función de barrera y preservar la integridad intestinal

› Garantizar un control inflamatorio y una respuesta inmune óptimos

En un estudio in vivo, se demostró que Bacillus subtilis DSM 29784 influye positivamente en las poblaciones bacterianas, al crear un efecto beneficioso sobre la actividad microbiana: por ejemplo, se observó que Bacillus subtilis DSM 29784 aumenta las poblaciones bacterianas que degradan los polisacáridos, así como las productoras de butirato (Jacquier et al. 2019).

Demostrar que Bacillus subtilis DSM 29784 también es activo in vivo, nos permite confiar en los datos obtenidos in vitro (Rhayat et al. 2017).

Bacillus subtilis DSM 29784 puede fortalecer la barrera intestinal al aumentar la expresión de proteínas de las “tight junctions”.

Además, refuerza y modula la respuesta inflamatoria mediante la inhibición de la degradación de IkB, evitando así la translocación de NF-κB. Al hacer esto, se controla la expresión de compuestos proinflamatorios, como la IL-8 y la enzima iNOS (Rhayat et al. 2019).